比色法

1.原理 　　固醇类化合物与酸试剂作用，可脱水，发生聚合反应并产生强的颜色反应。

2.适用范围 　　此方法适用于动物性食物中胆固醇的测定。

3.仪器 （1）实验室常用设备 （2）分光光度计 （3）电热恒温水浴

4.试剂 　　所有试剂，如未注明规格，均指分析纯，所有实验用水，均为蒸馏水。 （1）石油醚 （2）无水乙醇 （3）浓硫酸 （4）冰乙酸(优级纯） （5）磷酸 （6）胆固醇标准（美国Sigma公司） 　　标准储备液：准确称取胆固醇100mg，（胆固醇标准开启后放在干燥器内）溶于冰乙酸中，并定溶至100ml。其浓度为1g/L。可保存2个月。 　　标准工作液：取标准储备液10ml，用冰乙酸定溶至100ml。其浓度为0.1g/L。此液用时临时配制。 （7）铁矾显色液： 　　储备液：溶解4.463克硫酸铁铵［FeNH4（SO4）2·12H2O］于100ml 85%磷酸中贮于干燥器内，此溶液在室温中稳定。 　　* 铁矾储备液须在实验前两周配制，因硫酸铁铵不易溶解，每天要进行短时间的振摇待溶质完全溶于磷酸后再定溶到体积。 　　工作液：吸取储备液10ml用浓硫酸稀释到100ml。贮于干燥器内。 （8）氢氧化钾50%溶液：溶解50g氢氧化钾于水中，定溶至100ml。 （9）氯化钠5%溶液：溶解5克氯化钠于水中，定溶至100ml。 （10）纯氮（99.99%）

5.操作步骤

5.1样品脂肪的提取与测定：根据食物种类分别用索氏提取法、研磨法和罗高氏法提取脂肪，并计算出每100克食物中脂肪含量。

5.2样品胆固醇的测定：准确称取提取的油脂3-4滴（约含胆固醇300-500μg） 取样量可按样品中胆固醇的浓度增减。置于25ml试管内，加入4ml无水乙醇，0.5ml50%氢氧化钾，在65℃恒温水浴中皂化1小时。皂化时每隔20-30分钟振摇一次使皂化完全。皂化完毕，取出试管，冷却。加入3ml 5%氯化钠、10ml石油醚，盖紧玻璃塞，振摇2分钟，静置分层（一般需1小时以上）。

　　取上层石油醚2ml，置于10ml具玻璃塞的试管内，在65℃恒温水浴中用氮气吹干，加入4ml冰乙酸，2ml铁矾显色液，混匀，放置15分钟后560-575nm下比色。 5.3标准曲线：准确吸取胆固醇工作液0；0.5；1.0；1.5；2.0ml分别置于10ml试管内，在各管内加入冰乙酸，使总体积达4ml。沿管壁加2ml铁矾显色液，混匀，在15-90分钟内，560-575nm下比色。

6.分析结果 　　样品中胆固醇含量（mg/100g）=C×V/V\'×1/W×F/1000 式中 　　C=测得的光密度值在胆固醇标准曲线上显示的胆固醇量（μg） 　　V=石油醚总体积（ml） 　　V\'=取出的石油醚体积（ml） 　　W=称取油脂重量（g） 　　F=样品的脂肪含量（g/100g） 　　1/1000=折算成每100克食物中胆固醇的毫克数。

7.注意事项 　　同一实验室同时或连续两次测定结果之差不得超过平均值的10%。